Основанная на одноименном фильме 2007 года, Spider-Man 3 ставит игрока на место титульного героя, который вновь пытается защитить Нью-Йорк от объединенной угрозы Нового Гоблина, Песочного человека и Венома.
Стиль игры похож на Spider-Man 2, в котором игрок может свободно исследовать крупномасштабную версию Нью-Йорка в стиле "песочницы", на этот раз в куда более крупном городе с возможностью исследовать метро и канализационные системы. Игра также позволяет игрокам участвовать в приключениях по сюжетным линиям, не раскрытым в третьем фильме, например, сталкиваться со старыми знакомыми злодеями Человека-паука, такими как Крейвен-охотник, Ящер, Скорпион, Носорог и Кингпин, или разбивать различные бандитские группировки.
Одним из основных моментов новой игры является включение черного костюма симбиота Человека-паука. В традиционном красно-синем костюме Человек-паук более быстр и более принят публикой. Надевая черный костюм, Человек-паук становится сильнее и агрессивнее. Черный костюм разрешен в различных точках игры, но не может быть выбран игроком и не оказывает вредного воздействия. Игра также включает в себя "cineractives" - кинематографические сцены, в которых можно участвовать с помощью нажатий кнопок или движений контроллера.